近年來，源自誘導多能干細胞的類器官為研究人體器官發(fā)育提供了模型。據(jù)報道，單細胞轉錄組學可以對這些系統(tǒng)中的細胞狀態(tài)提供高度分析。然而，此前還沒有辦法直接衡量血統(tǒng)關系。

基于此，浙江大學校友何志松及其同事共同開發(fā)了譜系記錄儀iTracer，它將報告條形碼與可誘導的CRISPRCas9疤痕相結合，并兼容單細胞和空間轉錄組學，可以探索大腦過程中的克隆性和譜系動態(tài)。類器官發(fā)育。

詳細而言，記錄器允許從初始化的iPSC 庫進行克隆跟蹤，以及使用誘導疤痕在不同時間點進行譜系記錄，從而允許克隆分析和探索細胞命運建立的時間動態(tài)，從而避免了許多輪式的低效率問題。誘導疤痕標記。

2021年12月30日，題為《人腦類器官中的譜系記錄》（Lineagerecordingin humancereborgoids）的相關論文發(fā)表在NatureMethods上[1]。

長期以來，何志松課題組對人類早期胚胎發(fā)育過程中的中樞神經系統(tǒng)特別是大腦發(fā)育、神經發(fā)育相關疾病的發(fā)病機制及其發(fā)育表現(xiàn)產生了濃厚的興趣。

在研究中，他們利用腦類器官微三維組織培養(yǎng)技術，誘導人類胚胎干細胞或誘導多能干細胞分化為不同類型的腦神經元和其他細胞類型，從而模擬人腦的早期發(fā)育過程。和機制研究。

為了全面描述這一過程中細胞分子特征的變化，他們大量利用單細胞測序技術，特別是單細胞轉錄組技術，獲取期間可能發(fā)生的動態(tài)細胞狀態(tài)，并通過整合樣本不同時間點的數(shù)據(jù)，并采用各種計算分析方法來推斷不同細胞類型的發(fā)生過程。

然而，這種方法也有局限性。目前的單細胞測序技術需要對細胞進行破壞性測量，因此只能獲得最終測量時細胞狀態(tài)的單個快照。

這樣就無法得知細胞的歷史狀態(tài)，更無法得知細胞的譜系信息，這意味著這些細胞系是同一干細胞在特定時間分裂分化產生的后代細胞。

這些信息對于更好地繪制早期大腦發(fā)育圖至關重要。為此，何志松和同事需要一種與當前單細胞測序技術兼容、能夠進一步獲取細胞譜系信息的新技術，即細胞譜系追蹤。

目前，兼容單細胞轉錄組測序的細胞譜系追蹤技術主要分為兩類：

一類是靜態(tài)序列標記，涉及構建高度復雜的條形碼序列庫，轉染并整合到干細胞中，以標記不同的干細胞；

另一類是基于CRISPR技術的動態(tài)序列標簽，通過誘導CRISPR編輯系統(tǒng)在特定序列上引入一系列隨機突變，通過在每個干細胞中檢測到的突變組合來構建細胞譜系信息。

兩種技術各有優(yōu)缺點：靜態(tài)序列標簽只能獲取單個時間點的譜系信息；基于CRISPR技術的動態(tài)標簽存在嚴重的標簽沖突問題，多個獨立的編輯事件會產生相同的突變，從而導致重建的譜系信息不準確。

為了更好地解決這一問題，何志松和他的同事將這兩類技術進行了整合，開發(fā)了iTracer技術。 iTracer包含可用于在起始時間點標記不同干細胞的靜態(tài)序列標簽，以及基于CRISPR編輯系統(tǒng)的動態(tài)序列標簽。與具有可誘導Cas9蛋白基因的干細胞相結合，可以在特定時間點生成額外的隨機序列。突變以獲得第二層細胞譜系信息。

綜上所述，該技術綜合了兩類現(xiàn)有技術的優(yōu)點。它不僅可以獲取多個時間點的譜系級信息，還可以減少標記沖突的影響。

然后，他們在大腦類器官系統(tǒng)中使用iTracer 技術來研究大腦類器官中不同類型神經元之間的譜系連接。

他發(fā)現(xiàn)代表不同大腦區(qū)域的神經元往往是由不同的多能干細胞產生的，而同一多能干細胞產生的子代細胞在空間分布上表現(xiàn)出聚集的分布特征。

這一現(xiàn)象暗示，在分裂和分化的過程中，腦類器官的細胞并沒有發(fā)生明顯的細胞遷移，因此它們的子代細胞呈簇狀分布，并在相似的微環(huán)境下被誘導成相同類型的神經元。

使用長期光片顯微鏡對稀疏核標記的腦類器官進行的后續(xù)觀察進一步支持了這一假設。

在此基礎上，通過引入不同時間點的動態(tài)序列標記，我們還可以獲得腦類器官中不同細胞類型，特別是不同類型神經元命運決定的關鍵時間點，并分析同一多能干細胞的不同作用。比較后代神經元的分化。

此外，通過在iTracer的基礎上額外引入針對目的基因的gRNA，可以利用iTracer記錄細胞譜系信息，同時基于CRISPR技術對目的基因進行基因敲除，進而敲除相應的基因。如何影響細胞譜系的發(fā)育和分化。

據(jù)報道，何志松和同事還將iTracer-perturb技術應用于腦類器官，對TSC2基因對腦類器官神經元發(fā)育的影響進行了初步研究。

結合基于CRISPR技術的iTracer技術進行基因敲除

該研究始于2017年，何志松課題組主要關注的生物系統(tǒng)一般與組織發(fā)育、組織再生、干細胞分化等相關，其中包含大量細胞狀態(tài)的動態(tài)轉變。

因此，當時逐漸成熟的大規(guī)模單細胞轉錄組測序技術讓他能夠研究這些動態(tài)過程。然而，由于單細胞測序技術對被測細胞具有破壞性，如何通過實驗手段直接獲取不同細胞之間的譜系關系，成為何志松和同事們急于解決的問題。

當時，靜態(tài)序列標記技術CellTag，包括華盛頓大學遺傳與發(fā)育生物學系教授Sam Morris和柏林醫(yī)學系統(tǒng)生物學研究所（BIMSB）的Jan Philipp Junker團隊組成德國團隊的動態(tài)序列標記技術LINNAEUS剛剛興起。

它們都是與單細胞轉錄組測序技術兼容的細胞譜系追蹤技術，何志松研究團隊也已經開始使用。但隨后，他們很快發(fā)現(xiàn)了上述技術的局限性，因此他們想開發(fā)一種能夠將靜態(tài)序列標簽和動態(tài)序列標簽結合起來的方法。

這個想法成為一個項目，并于2018年正式啟動。他們首先構建了含有iTracer元件的轉座子質粒載體，并開始在腦類器官中使用批量測序來證明iTracer技術的可行性。

在確定該技術可行后，他們從2019年開始在腦類器官系統(tǒng)中使用iTracer技術，從而獲得不同時間點動態(tài)序列標記誘導的腦類器官的單細胞轉錄組測序數(shù)據(jù)并進行數(shù)據(jù)分析。

2020年初，迎來了數(shù)據(jù)分析的初步結果，何志松從中了解到，多能干細胞在分裂、分化、產生腦類器官的過程中并沒有明顯的遷移?；诖耍僭O同一譜系的細胞在空間中聚集在一起。

為了證明這一假設的合理性，一方面，他和研究團隊其他成員將iTracer技術與空間轉錄組相結合，觀察腦類器官中不同細胞譜系的分布；另一方面，他們還利用長期光片顯微鏡技術記錄了大腦類器官的早期發(fā)育，并追蹤了幾種細胞核被標記的干細胞及其后代。

兩種方法都驗證了上述假設。然后，通過比較不同時間點引入的動態(tài)序列標簽的樣本，何志松推斷了腦類器官中不同神經元命運的重要時間點，并生成了相應時間的腦類器官的單細胞轉錄組數(shù)據(jù)。確認此時存在不同的神經祖細胞。

考慮到此次使用的是10x Genomics的單細胞測序技術，實際上只測量了每個大腦類器官中的極少數(shù)細胞。這導致每個細胞譜系只能獲得幾個細胞的數(shù)據(jù)，并且也限制了每個細胞譜系獲取數(shù)據(jù)的能力。使得直接比較變得困難。

為此，研究團隊還對單個類器官進行了顯微解剖，并對所得的每個部分進行了深入的單細胞轉錄組測序，從而實現(xiàn)了細胞譜系的充分采樣。

最后，他們擴展了iTracer技術，在原有的iTracer載體的基礎上引入了針對目標敲除基因的gRNA，從而將其與基于CRISPR技術的基因敲除相結合。

這促使他們對由此產生的iTracer-perturb 技術進行了初步應用，并研究了TSC2 基因在大腦類器官發(fā)育中的作用，以及對細胞譜系的潛在影響。

（來源：自然方法）

可用于所有體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)

研究中還發(fā)生過一個小插曲。何志松說：不同神經元富集不同多能干細胞譜系的結果一開始是出乎意料的。因為我們認為用于培養(yǎng)大腦類器官的多能干細胞是一致的，所以很自然地預期不同的干細胞同樣可能產生各種類型的神經元。

因此，他當時的第一反應就是分析方法可能有問題，或者由于某種原因不同的干細胞確實有產生不同神經元的傾向。

直到一次討論，他才恍然大悟，這個結果其實可以用干細胞遷移率低導致的細胞譜系分布不均勻，以及不同神經元空間分布不均勻來解釋。

為了進一步證實這個想法，他設計了將iTracer與空間轉錄組學和長期光片顯微鏡相結合的實驗，這些實驗最終證實了上述想法。

談到潛在的應用，他表示：目前這項技術的應用應該停留在基礎研究領域，但絕不限于大腦類器官系統(tǒng)。理論上，iTracer技術可以用于所有體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，唯一的要求是所使用的干細胞必須具有可誘導的CRISPR編輯系統(tǒng)。

出生于廣東，本科就讀于浙江大學生命學院

何志松，廣東中山人，1987年出生，就讀于浙江大學生命科學學院生物信息學專業(yè)。 2009年被推薦至中國科學院上海生命科學研究院馬克斯·普朗克學會伙伴計算生物學研究所，師從Philipp Khaitovich研究員。

2015年博士畢業(yè)后，繼續(xù)在課題組工作至2017年。在中科院期間，何志松以第一作者或通訊作者在《自然神經科學》《分子精神病學》等期刊發(fā)表多篇論文。

2018年，他來到德國萊比錫馬克斯·普朗克進化人類學研究所，加入Barbara Treutlein教授的單細胞基因組學研究組進行博士后研究。

2019年，他隨團隊轉到瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學院生物系統(tǒng)科學與工程系，在Truitling團隊繼續(xù)博士后工作。

在此期間，何志松的研究方向是單細胞功能基因組學，特別是單細胞轉錄組數(shù)據(jù)的分析和方法開發(fā)。他還利用大腦類器官和其他類器官系統(tǒng)作為模型來研究早期人類大腦和其他器官的發(fā)育。細胞命運決定機制。

來瑞士后，他以第一作者或通訊作者身份在Nature、Genome Biology、Stem Cell Report等雜志上發(fā)表論文。

2021年7月，何志松成為團隊高級研究助理。在科學研究的基礎上，他開始負責計算資源管理和一些學生指導。

對于本文的后續(xù)研究，他表示：我們正在組內其他幾項研究中使用iTracer技術，并取得了很好的效果。同時，我們也希望進一步完善iTracer，主要研究CRISPR系統(tǒng)在引入動態(tài)序列標記方面效率較低的問題。

-結尾-